March 2020
De vuelta con el Grapevine pinot gris virus, y los que no disponen de PCR a tiempo real? (Autora: A.B. Ruiz-García)
18/03/20 19:11 ..... Divulgacion
Y para los que no disponen de un equipo de PCR a tiempo real? ¿cómo se puede detectar?
Pues con una RT-PCR convencional y para ello os indicamos unos iniciadores que amplifican diferentes regiones del genoma del virus.
Nuestra recomendación, al menos utilizar dos PCRs diferentes, porque este virus es variable y así disminuimos posibilidades de falsos negativos.
Iniciadores de Beuve et al.:
Proteína de movimiento (770pb)
Pg-Mer-F1 5′-GGAGTTGCCTTCGTTTACGA-3′
Pg-Mer-R1 5′-GTACTTGATTCGCCTC GCTCA-3′
Iniciadores de Glasa et al.:
5’UTR (618pb)
GPG-14F 5’-AATTGATCCCGTGTAGTGC-3’
GPG-632R 5’-TCCGAGGACGATGAACCTC-3’
Proteína de movimiento (302pb)
GPG-5637F 5’-ATTGCGGAGTTGCCTTCAAG-3’
GPG-5939R 5’-CTGAGAAGCATTGTCCCATC-3’
Proteína de cápside (411pb)
GPG-6609F 5’-GAGATCAACAGTCAGGAGAG-3’
GPG-7020R 5’-GACTTCTGGTGCCTTATCAC-3’
El protocolo para su detección por RT-PCR convencional es el siguiente:
Muestreo: 4 brotes terminales (10 cm) alrededor de la cepa
Purificación de ácidos nucleicos: RNeasy Plant kit o similar
Preparación del cóctel: Para cada reacción de 25 microlitros (3 microlitros de RNA purificado)
H2O 10,7 microlitros
Tampón 5x Promega 5 microlitros
Cl2Mg 25 mM (uso 1,5 mM) 1,5 microlitros
dNTP (2,5 mM cada uno) uso 0,25 mM 2,5 microlitros
Iniciador 1 (25 microM) uso 1microM 1 microlitro
Iniciador 2 (25 microM) uso 1microM 1 microlitros
GoTaq G2 Promega (5 U/microlitro) 0,2 microlitros
AMV Promega (10 U/microlitro) 0,1 microlitro
Condiciones del Termociclador
30 min ------------------ 45ºC
4 min ------------------- 94ºC
40 ciclos: 30 s ---------------------- 92ºC
30 s ---------------------- 50ºC
1 min -------------------- 72ºC
10 min ----------------- 72ºC
Pues con una RT-PCR convencional y para ello os indicamos unos iniciadores que amplifican diferentes regiones del genoma del virus.
Nuestra recomendación, al menos utilizar dos PCRs diferentes, porque este virus es variable y así disminuimos posibilidades de falsos negativos.
Iniciadores de Beuve et al.:
Proteína de movimiento (770pb)
Pg-Mer-F1 5′-GGAGTTGCCTTCGTTTACGA-3′
Pg-Mer-R1 5′-GTACTTGATTCGCCTC GCTCA-3′
Iniciadores de Glasa et al.:
5’UTR (618pb)
GPG-14F 5’-AATTGATCCCGTGTAGTGC-3’
GPG-632R 5’-TCCGAGGACGATGAACCTC-3’
Proteína de movimiento (302pb)
GPG-5637F 5’-ATTGCGGAGTTGCCTTCAAG-3’
GPG-5939R 5’-CTGAGAAGCATTGTCCCATC-3’
Proteína de cápside (411pb)
GPG-6609F 5’-GAGATCAACAGTCAGGAGAG-3’
GPG-7020R 5’-GACTTCTGGTGCCTTATCAC-3’
El protocolo para su detección por RT-PCR convencional es el siguiente:
Muestreo: 4 brotes terminales (10 cm) alrededor de la cepa
Purificación de ácidos nucleicos: RNeasy Plant kit o similar
Preparación del cóctel: Para cada reacción de 25 microlitros (3 microlitros de RNA purificado)
H2O 10,7 microlitros
Tampón 5x Promega 5 microlitros
Cl2Mg 25 mM (uso 1,5 mM) 1,5 microlitros
dNTP (2,5 mM cada uno) uso 0,25 mM 2,5 microlitros
Iniciador 1 (25 microM) uso 1microM 1 microlitro
Iniciador 2 (25 microM) uso 1microM 1 microlitros
GoTaq G2 Promega (5 U/microlitro) 0,2 microlitros
AMV Promega (10 U/microlitro) 0,1 microlitro
Condiciones del Termociclador
30 min ------------------ 45ºC
4 min ------------------- 94ºC
40 ciclos: 30 s ---------------------- 92ºC
30 s ---------------------- 50ºC
1 min -------------------- 72ºC
10 min ----------------- 72ºC
Comments
orcid.org/0000-0001-8406-7963